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IdeS的介紹

免疫球蛋白 G 降解酶 (Immunoglubulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes, IdeS)，來自釀膿鏈球菌，是一種常見的來自 A 型鏈球菌的半胱氨酸蛋白酶，具有水解 IgG 的肽鏈內(nèi)肽酶活性，它可以識別抗體的鉸鏈區(qū)即CH1 結(jié)構(gòu)域和CH2 結(jié)構(gòu)域之間并特異性降解 IgG^[1]。

IdeS結(jié)構(gòu)特征

IdeS的底物特異性

到目前為止，IgG 是 IdeS 作用的唯一底物，研究發(fā)現(xiàn) IdeS 還不能作用于已知的可被其他半胱氨酸蛋白酶水解的合成產(chǎn)物?！癥”型的 IgG 分子是由兩條相似的重鏈和兩條相似的輕鏈構(gòu)成，是一種大分子四聚體 (約 150KD)，每一個(gè)輕鏈通過一個(gè)二硫鍵與重鏈連接，而兩個(gè)重鏈?zhǔn)窃阢q鏈區(qū)通過至少兩個(gè)二硫鍵連接。IdeS作用的斷裂位點(diǎn)位于 IgG 重鏈上 CH2 結(jié)構(gòu)域前面即鉸鏈區(qū)的 Gly-236 和Gly-237 之間，用 IdeS 酶切 IgG 的重鏈之后可以獲得 F(ab)2片段和完整的兩個(gè)單體 Fc 片段，與抗原結(jié)合的抗體重鏈 F(ab)2片段分子量大小約為 100KD，恒定區(qū) Fc 片段的分子量大小為 25KD。

IgG與IdeS相互作用機(jī)理

免疫球蛋白在人體免疫防御系統(tǒng)中起到至關(guān)重要的作用，通過特異性識別并介導(dǎo)專職吞噬細(xì)胞或補(bǔ)體系統(tǒng)或者二者同時(shí)作用來清除外來微生物。免疫球蛋白 Ig由識別抗原的 Fab 片段，以及通過靈活的鉸鏈區(qū)連接的恒定區(qū) Fc 片段組成，其中 Fc 效應(yīng)區(qū)域通過結(jié)合 C1q 觸發(fā)經(jīng)典的補(bǔ)體激活途徑。另外，IgG 抗體還可以通過結(jié)合細(xì)菌表面的結(jié)構(gòu)，并且暴露出抗體的 Fc 區(qū)域介導(dǎo)與吞噬細(xì)胞攜帶的FcγR受體相互作用。補(bǔ)體的經(jīng)典途徑最初是通過補(bǔ)體因子 C1q 與 IgG 或者 IgM特異性相互作用開始，結(jié)合后引起一系列的蛋白級聯(lián)反應(yīng)的激活，隨后導(dǎo)致補(bǔ)體因子 C3b 對免疫復(fù)合體表面的粘附。C3b 可以被吞噬細(xì)胞表面的補(bǔ)體受體識別，然后介導(dǎo)這些復(fù)合體的吞噬作用。除了具有保護(hù)性作用之外，IgG 也和疾病相關(guān)。在約 5%的人體內(nèi)，其對自身免疫疾病的影響已得以證實(shí)，在如下疾病中：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，重癥肌無力癥，免疫性 (或自發(fā)性) 血小板減少癥等。

為了避開特異性抗體 IgG 的不利因素，釀膿鏈球菌自身也發(fā)展出幾種不同的策略來對抗 IgG 功能的干涉。釀膿鏈球菌自身會(huì)表達(dá)一種細(xì)胞壁錨定表面蛋白，這種能夠介導(dǎo)蛋白-蛋白之間相互作用的成員稱之為M-蛋白家族，當(dāng)IgG的Fc片段與M蛋白結(jié)合后，F(xiàn)c結(jié)合區(qū)域被阻，也就不能與補(bǔ)體因子C1q結(jié)合，，從而使之Fc介導(dǎo)的吞噬作用受損。另外釀膿鏈球菌會(huì)分泌一種內(nèi)切糖苷酶 EndoS，能夠水解 IgG 上保守的 N-連接寡糖，水解之后的 IgG 降低了結(jié)合 Fc 受體的能力，從而使Fc介導(dǎo)的吞噬作用受損。

IdeS酶學(xué)性質(zhì)的研究

蛋白酶IdeS發(fā)揮高活性的pH范圍是 5.1~8.0，最適pH是 6.6，當(dāng)pH大于 10 時(shí)，該酶仍保持一定的活性，但在酸性條件下不穩(wěn)定。最適反應(yīng)溫度在 37℃左右，在大于熱力學(xué)溫度 42℃時(shí)有一定程度的降解。在 37℃，pH6.6，50mM 磷酸鹽緩沖液中反應(yīng) 30min 可完全切開 1μg 的 IgG 抗體 (≥95%) 所需的酶量定義為一個(gè)活性單位。

其他半胱氨酸蛋白酶相似，蛋白酶IdeS活性受蛋白酶抑制劑吲哚乙酸和碘乙酰胺的抑制，但是不同之處是，蛋白酶IdeS酶活性卻不受蛋白酶抑制劑 E64、血清胱抑素的影響，以及絲氨酸、天冬氨酸、金屬蛋白酶抑制劑等對IdeS酶活性也沒有影響。

IdeS酶的應(yīng)用

1、用于多克隆 IgG-Fc N-糖基化和異構(gòu)體分析

多克隆人免疫球蛋白 G (IgG) 糖基化的方法通常包括蛋白質(zhì)消化或聚糖釋放。雖然這些方法可以深入表征，但它們也會(huì)導(dǎo)致丟失有關(guān)某些亞類、同種異型和共同發(fā)生的翻譯后修飾 (PTM) 的信息。多克隆 IgG 的高度可變性使得它們的完整質(zhì)譜 (MS) 分析極具挑戰(zhàn)性，可以使用IgG 的 Fc區(qū)域，獲得N-糖基化和亞類和同種異型的其他 PTM 的綜合信息。人血漿 IgG 使用 Fc 特異性分離，然后將CH2結(jié)構(gòu)域用酶IdeS消化。獲得的 Fc 亞基混合物通過毛細(xì)管電泳 (CE) 和親水相互作用液相色譜 (HILIC) 與 MS 聯(lián)用進(jìn)行分析。CE-MS 提供了不同 IgG 亞類和同種異型的分離，而 HILIC-MS 允許分離不同的糖型及其氧化變體^[4]。

2、用于ADC藥物平均偶聯(lián)率的測定

可以將ADC藥物采用IdeS酶切，從鉸鏈區(qū)下方將抗體切開，然后還原，得到Fc/2、輕鏈L0，偶聯(lián)一個(gè)小分子藥物的輕鏈L1、Fd、偶聯(lián)1-3個(gè)小分子藥物的Fd1-Fd3，最后采用反相高效液相色譜(PR-MS)、親水相互作用色譜與質(zhì)譜聯(lián)用 (HILIC-MS)進(jìn)行分析^[5]。

3、在抗 AAV 中和抗體存在的情況下實(shí)現(xiàn)體內(nèi)基因治療

基因治療可通過AAV載體的全身給藥治療多種人類疾病的。然而，針對 AAV 衣殼的預(yù)處理中和抗體對 AAV 基因轉(zhuǎn)移構(gòu)成了主要限制，因?yàn)樗鼈兗词乖谙鄬^低的滴度也會(huì)阻止靶組織轉(zhuǎn)導(dǎo)。

IdeS可以有效地裂解抗AAV抗體，從而增強(qiáng) IgG 清除率，并將其在血液中的 AAV 中和活性降低到與肝細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)相容的水平。在 AAV 載體輸注時(shí)用IdeS進(jìn)行預(yù)處理是一種潛在的策略，可以在存在低至中度預(yù)先存在的抗衣殼抗體的情況下實(shí)現(xiàn)有效的全身基因轉(zhuǎn)移，這在人類中很常見，并且可能允許重復(fù)載體給藥^[6]。