背景:

       支原體（Mycoplasma）是對(duì)支原體科、無(wú)膽甾原體科和螺原體科的原核微生物總稱，是已知可以自由生活的最小生物，沒有細(xì)胞壁，形狀多樣可變，直徑一般是 0.1~0.3μm，基因組A-T 含量高，對(duì)常見的抗生素不敏感，對(duì)熱敏感。目前已從污水、植物、動(dòng)物、禽類、昆蟲、人、溫泉或其他高溫環(huán)境中發(fā)現(xiàn) 200 種左右支原體。
     細(xì)胞如果受到支原體污染，細(xì)胞生長(zhǎng)速度變慢，細(xì)胞產(chǎn)生病變或形態(tài)改變。連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞污染的概率大約15~35%，主要來(lái)源于 20 多種支原體，包括口腔支原體 （M.orale）、肺炎支原體（M.pneumoniae）、發(fā)酵支原體（M.fermentans）、精氨酸支原體（M.arginini）、萊氏無(wú)膽甾原體（A.laidlawii）和豬鼻支原體（M.hyorhinis）。
      人員操作、污染的細(xì)胞、原輔料（血清、胰酶、培養(yǎng)基），實(shí)驗(yàn)環(huán)境污染（生物安全柜、細(xì)胞間，培養(yǎng)箱）、實(shí)驗(yàn)儀器（水浴鍋、液氮罐）、實(shí)驗(yàn)耗材（培養(yǎng)皿、方瓶、細(xì)胞工廠）都可能是污染源。污染了的細(xì)胞一方面對(duì)生產(chǎn)帶來(lái)巨大影響，另外如果細(xì)胞產(chǎn)品、蛋白產(chǎn)品、病毒類產(chǎn)品受到支原體污染，最終會(huì)給患者帶來(lái)潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。因此，監(jiān)管部門要求企業(yè)對(duì)細(xì)胞庫(kù)，檢定用細(xì)胞和產(chǎn)品進(jìn)行支原體檢測(cè)，從源頭上進(jìn)行控制，盡早發(fā)現(xiàn)，確保放行產(chǎn)品不含支原體。對(duì)此，全球各國(guó)藥物監(jiān)管部門也發(fā)布了支原體檢測(cè)相關(guān)指南，檢測(cè)方法主要包括熒光染色法、培養(yǎng)法、生化檢測(cè)方法和核酸擴(kuò)增法。 上述檢測(cè)方法中，大多操作步驟相對(duì)比較煩瑣、靈敏性不高、不能區(qū)分支原體種類、需要特殊儀器或所需時(shí)間較長(zhǎng)。而PCR法操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單便捷，PCR擴(kuò)增后通過電泳分析即可確定是否有支原體污染，并可根據(jù)擴(kuò)增片段的大小大致預(yù)測(cè)至少11種所污染的支原體種屬，也可以對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)一步測(cè)序以確定具體的支原體種屬。

概述:

       Rhinogen^? Myco-Acid ^TM PCR支原體檢測(cè)試劑盒是一種通過巢式PCR法（Nested PCR）檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞等生物材料中是否存在支原體污染的檢測(cè)試劑盒。本支原體檢測(cè)試劑盒是利用兩對(duì)引物通過巢式PCR法特異性擴(kuò)增支原體基因組DNA片段，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)支原體的高靈敏度特異性檢測(cè)的。

圖1. Rhinogen^? Myco-Acid^TM PCR支原體檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)原理圖

      本試劑盒提供了PCR Mix（包含Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、dNTP和Loading Buffer），擴(kuò)增完畢后可以直接上樣電泳，可快速、有效、高靈敏度地檢測(cè)支原體污染。配套的陽(yáng)性對(duì)照，便于確定PCR檢測(cè)是否能正常工作及樣品中是否存在抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)。原核生物的rRNA堿基序列非常保守，而rRNA操縱子上編碼rRNA的DNA間隔區(qū)（space region）在各種生物種間的堿基序列差別很大，如16S和23S之間的間隔區(qū)。這個(gè)間隔區(qū)的DNA序列及長(zhǎng)度在支原體各個(gè)種屬間既有非常保守的部分，也有較大差異的部分。在編碼16S和23S的保守區(qū)DNA上設(shè)計(jì)一對(duì)F1/R1引物，用于擴(kuò)增16S和23S之間的間隔區(qū)，這就是巢式PCR的第一輪PCR（1st PCR），用于初步鑒定是否有支原體污染；然后在編碼16S和23S rRNA的DNA間隔區(qū)的保守區(qū)上設(shè)計(jì)一條F2引物，在編碼23S rRNA的DNA上設(shè)計(jì)一條R2引物進(jìn)行巢式PCR的第二輪PCR（2nd PCR）。通過巢式PCR可以大大提高檢測(cè)的特異性和靈敏度。

應(yīng)用: 

      本試劑盒確定可以擴(kuò)增的支原體種類及1st PCR和2nd PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度參考如下表：

試劑包裝: 

       Rhinogen^? Myco-Acid^TM PCR支原體檢測(cè)試劑盒包裝規(guī)格如下：

      1. 操作簡(jiǎn)單：試劑盒提供預(yù)混好的試劑，使體系配制操作簡(jiǎn)便；
       2. 快速檢出：通過PCR擴(kuò)增及電泳分析進(jìn)行支原體檢出只需4-5小時(shí)左右；
       3. 靈敏度高：PCR反應(yīng)非常靈敏，可以擴(kuò)增目的基因序列超過1000萬(wàn)倍；
       4. 特異性高：使用巢式PCR反應(yīng)，提高了檢測(cè)特異性。

保藏條件:

       采用冰袋運(yùn)輸，收到產(chǎn)品后請(qǐng)立即置于-20℃及以下條件下儲(chǔ)存。避免多次反復(fù)凍融。